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前沿科普——冬虫夏草菌丝体提取物通过抑制炎性因子及 Treg 细胞功能缓解肺纤维化
时间:2018-09-21 09:41来源:未知 作者:admin 点击:
        南京大学医学院侯亚义教授于2016年在发表《中国免疫学杂志》第32卷发表了《冬虫夏草菌丝体提取物通过抑制炎性因子及 Treg 细胞功能缓解肺纤维化》一文。南大医学院国家重点实验室通过详实科学的实验证实冬虫夏草菌丝体具有抑制炎症及平衡免疫缓解肺纤维化的功能,且这种作用可能是通过抑制炎性因子及 Treg 细胞功能达到的; 对此进行进一步研究将有利于阐明其抗纤维化的作用机制,为寻找抗肺纤维化药物提供新视角。
         实验所选取的冬虫夏草菌丝体提取物选自南京中科药业,正是中科牌蝙蝠蛾被毛孢菌丝体提取物胶囊的生产原料,中科牌蝙蝠蛾被毛孢菌丝体提取物胶囊是继中科集团旗下中科灵芝孢子油外另一明星产品。

冬虫夏草菌丝体提取物通过抑制炎性因子及 Treg 细胞功能缓解肺纤维化
 
岳会敏 刘 飞 李范林 马菲雅 沈苏南 侯亚义
( 南京大学医学院和生物医药技术国家重点实验室,南京 210093)
 
        [摘  要]  目的:观察冬虫夏草菌丝体( Hirsutella sinensis mycelium,HSM) 提取物对盲肠穿孔结扎( CLP) 小鼠的炎症反应和肺纤维化程度的影响。方法:建立 CLP 诱导脓毒症 5 d 和 10 d 小鼠模型,分别分为假术组( sham,n = 5) 、模型组( CLP,n =11) 、治疗组( HSM,n = 11) 。冬虫夏草菌丝体组在术前 2 h 和术后给予 HSM 提取物 200 mg / ( kg·d) ( 低于人体用量 0. 27 g /kg) ,假术组和模型组给予等量的生理盐水。利用 Q-PCR 检测了肺组织中炎性因子 TNF-α 和 IL-1β 及纤维化因子 TGF-β1、TIMP1 和 MMP9 的表达; 利用流式细胞术分析了小鼠外周血和脾脏中 Th1 细胞以及脾脏组织中 Treg 细胞的数量; 另外,还对肺组织切片进行了 HE 染色以及 α-平滑肌肌动蛋白( α-SMA) 和纤连蛋白( fibronection) 免疫组化染色。结果:模型组外周血和脾脏中 Th1 细胞以及脾脏组织中 Treg 细胞的数量较假术组显著降低,而 HSM 提取物治疗能上调上述细胞的数量。5 d 时,模型组肺组织中 IL-1β 及纤维化因子 TGF-β1、MMP9 和 TIMP1 表达显著上调,到第 10 天时有所降低但仍高于 sham 组,而治疗组上述因子表达明显降低; 各组肺组织 TNF-α  表达无显著差异;  HE 染色显示模型组肺部炎性样变明显,到第  10 天时炎性样变比 5 d 时减轻,而治疗组均有改善; 免疫组化显示与假术组比,模型组肺内间质 α-SMA 和 fibronection 表达明显增多,而治疗组肺内间质表达低于模型组。结论:HSM 提取物具有抑制炎症、平衡免疫及缓解肺纤维化的功能。
        [关键词] 冬虫夏草菌丝体; 炎症反应; 肺纤维化
       
        肺纤维化是一种慢性的、不可逆的肺部间质性疾病,可造成肺泡结构的破坏,进而导致病人呼吸困难,最终因呼吸衰竭而死亡[1]。此类疾病病因尚不明确,但被普遍认为与暴露于职业危害、环境因素及基因易感性相关[2]。肺纤维化预后较差,通常在患病早期启动炎症反应,以上皮细胞转分化、成纤维细胞大量增殖、纤维化病灶的形成以及肺结构破坏为特征[3]。上皮细胞向间质细胞转化( EMT) 和间质标志 vimentin 表达伴随着 E-cadherin 的表达消失都是肺纤维化的标志[4]。肺纤维化的发生和发展与TGF-β1 活化密切,TGF-β1 诱导过多的胶原和 ECM产生积聚以及基底膜 MMP / TIMP 失衡。由于其病理机制复杂,目前为止现代医学仍缺乏良好的临床治疗手段[5]。
        冬虫夏草菌丝体是我国传统的名贵中药材,它是由冬虫夏草菌寄生于蝙蝠蛾幼虫而形成的幼虫尸体和干燥子座的复合体。冬虫夏草现在常被用来治疗呼吸系统疾病,也有报道称其可作为抗氧化剂和血管生成抑制剂。近年来有研究表明冬虫夏草菌丝体可通过抑制 TGF-β1 表达及促进胶原降解缓解肝肾肺纤维化等功能[6-9]。Keshar 等[10]证实,脓毒症诱导的急性呼吸窘迫综合征( ARDS) 可能诱发持续的纤维化病变,本实验构建了 CLP 诱导脓毒症模型,主要目的是明确冬虫夏草菌丝体缓解肺纤维化的作用,探讨其作用的潜在机制。

1 材料与方法

1. 1 材料
1. 1. 1 实验动物 4 ~ 6 周龄的 C57BL /6 小鼠,雄性,体重 18 ~ 20 g,购自南京大学模式动物所,饲养于 SPF 级动物房内,保证饮食和饮水,昼夜循环,使用前饲养不少于 1 周。
1. 1. 2 药物与试剂 冬虫夏草菌丝体提取物由南京中科药业有限公司提供( 批号: 20140778) ; 免疫组化所用 fibronectin 抗体购自 SANTA CRUZ 公司, 1 ∶50 稀释  ; α-SMA 抗体是 abcam 公司产品,1 ∶ 200稀释; DAB 显示试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司( 产品编号: AR1022) ; SABC-AP 免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司(  产品编号: SA1050 ) ; 实验用流式抗体均为 eBioscience 产品。
1. 1. 3 实验动物处理 两种模型各 27 只小鼠在SPF 级动物房饲养 1 周后,随机分组,实验分组如下: ( 1) sham 组: 小鼠腹腔注射 100 μl /10 g 生理盐水,2 h 后用 4%水合氯醛( 200 μl / 每只) 麻醉小鼠打开腹腔暴露盲肠,不结扎不穿刺,然后将盲肠放入腹 腔,逐层关闭腹腔,缝好伤口; 每组 5 只小鼠; ( 2) 实验组: ①CLP 组: 小鼠腹腔注射 100 μl /10 g 生理盐水,2 h 后用 4%水合氯醛( 200 μl / 每只) 麻醉小鼠打开腹腔抽出盲肠结扎穿刺,之后将盲肠放入腹腔逐 层关闭腹腔,缝好伤口; 每组 11 只小鼠; ②治疗组: 冬虫夏草菌丝体液( 200 mg / kg) 预处理 2 h,随后进行 CLP 手术,术后每天菌丝体液( 200 mg / kg) 灌胃, 每组 11 只小鼠,术后 5 d 或 10 d 处死小鼠。
1. 2 方法
1. 2. 1 流式细胞术 将收集的细胞用 PBS 洗 3 遍,然后用 PBS 重悬并转移至标准 BD 流式管中,按抗体说明书加入相应用量的流式抗体,4℃ 避光孵育 30 min,PBS 洗 2 遍,重悬细胞后使用流式细胞仪检测。标记胞内因子的,PBS 洗两遍后,加 500 μl 4%的 PFA 室温固定 20 min,离心去上清; 加 500 μl 含0. 1%saponin 的PBS,破膜 15 min,离心去上清; 按抗体说明书加入相应用量的流式抗体,4℃ 避光孵育 30 min,然后用含 0. 1% saponin 的PBS 洗 2 遍,重悬细胞后上流式细胞仪检测。
1. 2. 2 Q-PCR 将肺组织匀浆后,加入 Trizol,提总RNA,核酸蛋白检测仪检测 RNA 的纯度和浓度后,取 1 g RNA 进行反转录。反转录体系( 20 μl) : 4 μl 5× RT buffer,2 μl dNTP,0. 5 μl RNase inhibitor,0. 5 μl Oligo dT,0. 5 μl ReverTra Ace,1 μg RNA,加DEPC 水至 20 μl; 采用三步法进行 Q-PCR 反应,反应在  Applied BioSystems 7300 Sequence DetectionSystem 中进行,得到各个基因的  Ct 值,然 后以GAPDH 为内参,按照 2ΔΔCt 进行计算确定目的基因的表达。其中   IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP9 和TIMP1 引物均按primer bank 查询设计合成,GAPDH引物根据文献合成。
1. 2. 3  组织学观察   肺组织取出后用 4% 多聚甲醛固定,常规 HE 染色,切片在光学显微镜 10×20 视野下观察肺组织形态变化。
1. 2. 4 免疫组化染色 石蜡切片脱蜡、水化后,热修复; 冷却后,3% H2 O2 阻断过氧化氢酶; PBS 洗 3遍,然后按抗体说明书滴加适当浓度的一抗,4℃ 孵育过夜; 按说明书滴加适量二抗,37℃ 孵育 45 min后,用 PBST 洗 3 遍,加底物 SABC 37℃ 孵育 20 min;随后用 PBST 洗 4 遍,DAB( 武汉博士德生物公司)显色; 复染透明后封片; 在光学显微镜 10 × 20 视野下观察。
1. 3 统计学方法 所有实验数据均重复 3 次以上, 结果以 x ± s 表示,应用 Prism5 软件统计分析并作图,组间比较采用 one-way ANOVA 分析,P <0. 05 认为有统计学意义。

2 结果

2. 1 冬虫夏草菌丝体对肺组织炎性反应的影响 Q-PCR 结果显示,与 sham 组相比,5 d CLP 组小鼠肺组织重要的炎性因子 IL-1β 的 mRNA 的表达升高( P <0. 05) ,而 HSM 治疗组IL-1β 的mRNA 表达相比 CLP组明显降低( P<0. 05) ; 此外,TNF-α 也有与 IL-1β 相似的变化趋势,但改变不明显,见图 1A。10 d CLP 组小鼠肺组织重要的炎性因子 IL-1β 的 mRNA 的相比5 d 模型组有所降低但仍高于 sham 组,而给予 HSM 治疗后降低( P<0. 05) ; 此外,TNF-α 也有与 IL-1β 相似的变化趋势,但改变不明显,见图 1B。
肺组织 HE 染色显示,模型组小鼠的肺组织出现炎性细胞浸润、系膜基质增生,血管充血等变化; 给予 HSM 提取物治疗后,上述症状减轻。见图 1C。以上结果说明肺组织炎性样变随病程进展而减轻, 而冬虫夏草菌丝体改善了小鼠肺组织炎性病变。
2. 2 冬虫夏草菌丝体对小鼠免疫细胞的影响  本实验利用流式细胞术研究了 HSM 提取物对小鼠脾脏中 Treg 细胞以及 PBMC 和脾脏中 Th1 细胞数量的影响。结果显示: 与 sham 组相比,5 d CLP 组小鼠脾脏中 Treg 细胞数量均显著增多( P < 0. 05) ,而与 CLP 组相比,给予 HSM 提取物治疗后,小鼠脾脏中 Treg 细胞数量明显降低( P<0. 05) ,见图 2A; 10 d 组各组间变化趋势与 5 d 组相似,见图 2B; 与 sham组相比,5 d CLP 组小鼠脾脏中 Th1 细胞数量显著减少( P < 0. 05) ,而与 CLP 组相比,给予 HSM 提取物治疗后,小鼠脾脏中 Th1 细胞数量有显著增加( P<0. 05) ,见图 3A; 10 d 组各组小鼠脾脏中 Th1 细胞数量变化趋势与 5 d 组相似,见图 3B ; 与 sham 组相比,5 d 和 10 d CLP 组中小鼠 PBMC 中 Th1 细胞数量均有下降趋势,而给予 HSM 提取物治疗后 Th1 细胞数量有增多的趋势,见图 3A 和图 3B。
2. 3 冬虫夏草菌丝体对肺组织纤维化分子表达的影响 Q-PCR 结果显示,5 d CLP 组小鼠肺组织TGF-β1、金属基质蛋白酶 9 ( MMP9) 和金属蛋白酶组织抑制物 1( TIMP1)  的 mRNA 表达均显著上调;而 HSM 治疗组小鼠肺组织 TGF-β1 和 MMP9 的表达与 CLP 组相比均有显著下降( P < 0. 05) ,TIMP1有下降趋势; 见图 4A; 10 d CLP 组小鼠肺组织 TGF-
β1 的 mRNA 表达有上调趋势,MMP9 和 TIMP1 的mRNA 表达相比第 5 天时有所降低但仍显著高于sham 组,而与 CLP 组相比,给予 HSM 提取物治疗后,TGF-β1 和 MMP9 的表达均明显下调,见图 4B;提示 CLP 组小鼠肺部可能出现纤维化病变且纤维化病变在发病后期有减轻的趋势,经 HSM 提取物治疗后小鼠肺部 ECM 的合成和降解失衡得到控制、肺纤维化病变可能得到改善。
2. 4 冬虫夏草菌丝体对肺组织 α-SMA 和 fibrone-ctin 蛋白表达影响 α-SMA 和fibronectin 在sham 组小鼠肺组织内表达很弱; 经过 CLP 手术后表达增强,其主要表达于肺上皮细胞和肺内间质中;   而给予HSM 提取物治疗后,两种蛋白的表达明显减少见图4C 和图 4D。它们在不同时间点的表达也有不同。

3 讨论

在肺纤维化的发生和发展过程中,肺组织受到 损伤,由于炎症区域会出现明显的巨噬细胞、中性粒  细胞和淋巴细胞的浸润,这些浸润的炎症细胞可以 产生 IL-1、TNF-α 和 MCP-1 等细胞因子,进而形成复杂的细胞因子网络,调控间质成纤维细胞和肺泡 上皮细胞的增殖和凋亡,导致 ECM 活化增殖,最终促进肺纤维化的发生。Th1 细胞产生的 IFN-γ 可以抑制 TGF-β 表达,抑制胶原产生而减轻肺纤维化损伤,本实验中 CLP 组脾脏中 Th1 细胞数量较 sham 组减少,给予 HSM 治疗后有明显上调。此外,肺组织炎性因子 TNF-α  和 IL-1β  的 mRNA 水平表达量以及肺 HE 染色结果显示,进行 CLP 处理第 5 天时炎症因子表达升高较为显著且肺组织损伤较明显, 而到第 10 天时炎症因子有所改善; 给予冬虫夏草菌丝体治疗能够显著改善小鼠肺间质炎性细胞浸润情 况和降低肺组织炎性因子的表达。证实在 CLP 诱导脓毒症早期肺组织以炎症改变为主,随病程向晚 期发展,炎性改变减弱; 冬虫夏草菌丝体具有抑制炎症和调节免疫的功能。
为了进一步探讨 HSM 发挥作用的机制,我们分析了脾脏中 Treg 细胞比例以及外周血和脾脏中 Th细胞比例,发现 HSM 能够显著降低 CLP 引起的脾脏中 Treg 细胞比例增多,对 Th 细胞也有部分影响。
纤维母细胞异常转化为成纤维细胞,进而产生大量 ECM 并分泌因子影响相邻细胞的功能11。金属基质蛋白酶( MMPs)   是分解胞外基质的主要酶类,而金属蛋白酶组织抑制物( TIMPs)  可以特异性的抑制其对 ECM 的分解作用,两者对维持 ECM 合成和降解的平衡至关重要。除了纤维化细胞过表达MMP / TIMPs,上皮细胞向间质转化( EMT) 也是肺纤维化的显著特征; 在 EMT 过程中,细胞失去胞间接合蛋白E-cadherin 并表达α-SMA 和vimentin 等间质标志。本实验中肺组织纤维化相关因子 TGF-β1 、MMP9 和 TIMP1 的 mRNA 水平表达量在进行 CLP处理第 5 天时升高较为显著,到第 10 天时有所下降但仍高于 sham 组,而给予 HSM 治疗后均有相应改善。免疫组化结果也表明α-SMA 和fibronectin 在进行 CLP 处理第 5 天时升高较为显著,到第 10 天时有所下降但仍高于 sham 组,给予 HSM 提取物治疗后小鼠肺部 α-SMA 和 fibronectin 表达均下降,说明冬虫夏草菌丝体具有抗肺纤维化的功能。
本研究结果证实冬虫夏草菌丝体具有抑制炎症及平衡免疫缓解肺纤维化的功能,且这种作用可能是通过抑制炎性因子及 Treg 细胞功能达到的; 对此进行进一步研究将有利于阐明其抗纤维化的作用机制,为寻找抗肺纤维化药物提供新视角。

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